As far as the erythroid series is concerned, the currently available peripheral blood parameters supply laboratory personnel with an effective screening for the differential diagnosis of anemias based on the measurement of mean cell volume (MCV), as well as on the assessment of regenerative capability (evaluation of reticulocytes and immature reticulocyte fraction) (Figures 1 to 4).

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Figura 1. Referti strumentali ADVIA 2121 e Sysmex2100 del sangue periferico di un paziente con grave anemia normocitica associata a reticolocitosi con aumento della frazione reticolocitaria immatura (IRF).

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Figura 2. Referti strumentali CELLDYN 4000 e LH750 del sangue periferico di un paziente con grave anemia normocitica associata a marcata riduzione della frazione reticolocitaria immatura (IRF).

 

 

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Figura 3. Quattro differenti referti strumentali del sangue periferico di pazienti con grave anemia macrocitica/megaloblastica.

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Figura 4. Quattro differenti referti strumentali del sangue periferico di pazienti con anemia microcitica.

 

 

In the context of the differential diagnosis of microcytic anemias, the availability by different technologies of parameters such as the M/H ratio (% microcytic/% hypochromic RBCs) (Figures 5 and 6), MAF (Microcytic Anemia Factor), RBC -y (hypochromic RBCs), LHD (Low Hemoglobin Density), CHr and RetHE (reticulocyte hemoglobin concentration), makes the screening between microcytic iron -deficiency anemia and thalassemia minor possible (Figure 7). As for hemolytic anemias caused by alteration of the erythrocyte membrane, some parameters available, such as % Hyper (the percentage of hyperchromic RBCs) and MCVr (MCV of reticulocytes detected in the specific channel), are useful for the identification of spherocytes. The presence of a double erythrocyte population (dimorphism) is easily visible in the distribution histogram of erythrocyte volume. The possibility of flagging and/or counting, by automated methods, erythroblasts present in the circulation (Figure 8), as well as fragments of RBCs (Figure 9), is another tool of great importance for an immediate screening. Qualitative microscope validation of the result it is however necessary with most of the flagged anomalies.

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Figura 5. L’analisi combinata sulla stessa popolazione eritroide delle curve di distribuzione dei volumi (RDW) e del contenuto in Hb (HDW) consente di identificare le percentuali circolanti di globuli rossi macrocitici, microcitici, ipocromici e ipercomici, utilizzando la tecnologia Siemens.

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Figura 6. Un rapporto MICRO/HYPO (%emazie microcitiche/% di emazie ipocromiche) >1 o < 1 è suggestivo per la presenza, rispettivamente, di una popolazione microcitica da trait talassemico, ovvero da carenza marziale: questo parametro è disponibile sui sistemi ADVIA.

 

 

 

Zini_nuovi_parametri_strumentali_Figura_7

Figura 7. La presenza di un ridotto contenuto di ferro nella popolazione dei reticolociti è il primo indicatore di una emopoiesi da carenza marziale sia reale che funzionale.

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Figura 8. Il conteggio degli eritroblasti nel SP è oggi incluso nei parametri forniti dagli analizzatori.

 

 

Figura 9. Il conteggio in automazione dei frammenti di GR nel SP è oggi disponibile con due diverse tecnologie, Siemens e Sysmex.

Figura 9. Il conteggio in automazione dei frammenti di GR nel SP è oggi disponibile con due diverse tecnologie, Siemens e Sysmex.

 

Instrumental quantitative analysis of PLTs is very important to identify artifacts that can cause pseudothrombocytopenia or pseudothrombocytosis: such conditions are associated with the presence of specific alarms and/or abnormal PLT volume distribution in the histograms. Particular attention should be paid to the possible lack of separation of PLT clusters from background noise or from the erythrocyte population (Figure 10). The measurement of the mean volume of PLTs (MPV) and the immature PLT fraction (IPF) is quite useful to point out the presence of circulating large PLTs that can be abnormal giant forms or young reticulated PLTs. All hematologic systems perform a double PLT count to provide an accurate and reproducible result, mainly useful in cases of true thrombocytopenia. The CELL DYN Sapphire system counts PLTs using three different methods: optical light measurement, electrical impedance and flow cytometry using the CD61 monoclonal antibody as a PLT marker (Figure 11).

 

Figura 10. In presenza di aggregati piastrinici tutti le tecnologie forniscono un allarme accurato e preciso, che indirizza immediatamente alla revisione microscopica del campione di sangue periferico.

Figura 10. In presenza di aggregati piastrinici tutti le tecnologie forniscono un allarme accurato e preciso, che indirizza immediatamente alla revisione microscopica del campione di sangue periferico.

Figura 11. La tecnologia Abbott (CELL DYN Sapphire) è in grado di fornire il conteggio delle piastrine utilizzando tre differenti canali: ottico (PLTo), impedenziometrico (PLTi) e citofluorimetrico, utilizzando l’anticorpo monoclonale CD61 (CD61).

Figura 11. La tecnologia Abbott (CELL DYN Sapphire) è in grado di fornire il conteggio delle piastrine utilizzando tre differenti canali: ottico (PLTo), impedenziometrico (PLTi) e citofluorimetrico, utilizzando l’anticorpo monoclonale CD61 (CD61).

 

 

As far as WBCs are concerned, last generation cell counters are able to measure and classify the different types of normal leukocytes in peripheral blood with good precision and accuracy, both when they are within in the reference intervals and in the presence of proportional abnormalities of one or more categories. For this first analytical step, the quantitative evaluation, automated hematology instruments do replace human operators: in effect, they are considerably more reproducible than the microscopic method, thanks to the large number, up to many thousands, of cells that are analyzed in homogeneously mixed suspensions using objective and standardized techniques, not influenced by artifacts such as the irregular distribution on cell on the stained blood film. Such improved precision is particularly important in the presence of severe leukopenia, with immediate benefits for the longitudinal monitoring of hematological variations in patients who undergo myeloablative therapy. Thus the inherent precision and accuracy of current technologies have significantly improved the quantitative evaluation, which was the weakest aspect of the traditional manual WBC count. Clinical implications are outstanding, so that it is possible to fully rely on automation for samples that are highly cytopenic, but qualitatively normal. Even in the presence of quantitative alterations of one or more leukocyte populations with normal morphology, the management in automation allows accurate and precise differential count reporting. Analytical accuracy is very high for neutrophils, lymphocytes and eosinophils; significant discrepancies, on the other hand, are still observed for the counting of monocytes, that strongly depends on the analytical methodology, and basophils, owing to their very low frequency among circulating leukocytes.

A fundamental function of the automated WBC counters is represented by their capacity for identifying and flagging the presence of atypical and/or immature cells, by means of specific signals that lead to select the fraction of the analyzed blood samples that require a microscopic revision. Figures 12 to 15 show four instrumental result reports from samples with acute leukemias analyzed with different technologies: in each of them the presence of immature and/or blastic cells is suggested by specific instrument flags.

 

Figura 12. Referto XE-2100 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta mieloide: nella zona degli allarmi (Flags) compaiono le segnalazioni per cellule immature e o atipiche.

Figura 12. Referto XE-2100 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta mieloide: nella zona degli allarmi (Flags) compaiono le segnalazioni per cellule immature e o atipiche.

Figura 13. Referto ADVIA2120 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta a promielociti: nella zona degli allarmi (allarmi morfologici) compaiono le segnalazioni +++ per blasti e per granulociti immaturi. Il conteggio strumentale dei blasti è di 30.9%, valore confermato alla revisione al microscopio.

Figura 13. Referto ADVIA2120 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta a promielociti: nella zona degli allarmi (allarmi morfologici) compaiono le segnalazioni +++ per blasti e per granulociti immaturi. Il conteggio strumentale dei blasti è di 30.9%, valore confermato alla revisione al microscopio.

Zini_nuovi_parametri_strumentali_Figura_14

Figura 14. Referto CELL DYN 4000 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta monoblastica: sono chiaramente evidenti le segnalazioni per presenza di blasti e di granulociti immaturi (IG).

 

 

Methods adopted by modern automated to characterize atypical cell are alternative and complementary to conventional morphology and cytochemistry. One-dimensional (histograms) or two-dimensional (cytograms) graphic representations of cell distributions are especially useful for such purpose: the different leukocyte classes, in fact, form separated clusters according those cell properties that are specifically analyzed by each methodology. In addition to flagging, innovative technologies have been developed to obtain a quantitative determination of some cell categories, such as precursors of the granulocytic series and/or blasts when they are present in peripheral blood samples. Like in the case of PLT count, instrumental analysis of leukocytes should also accurately and easily identify samples with artifacts: for instance, pseudoleukocytosis is usually caused by the presence of particles with size in the volumetric range of leukocyte count, while pseudoleukopenia, in which leukocyte count is falsely decreased owing to the loss of a portion of the circulating leukocyte count, generally depends on the agglutination of WBCs, sometimes mixed with agglutinated PLTs.

Finally, some automatic blood cell counters, as the Abbott last generation instruments, have the capacity, – using of monoclonal antibodies -, for measuring the percentages of circulating lymphocyte subsets (CD3, CD4 and CD8) and the CD4/CD8 ratio, including them in the peripheral blood cell count report (Figure 16).

 

Figura 15. Referto LH750 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta linfoblastica: sono chiaramente evidenti in rosso le segnalazioni per presenza di linfoblasti e di linfociti varianti.

Figura 15. Referto LH750 di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta linfoblastica: sono chiaramente evidenti in rosso le segnalazioni per presenza di linfoblasti e di linfociti varianti.

Figura 16. Referto CELL DYN Sapphire di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta monoblastica: sono chiaramente evidenti le segnalazioni per presenza di blasti e di granulociti immaturi (IG).

Figura 16. Referto CELL DYN Sapphire di sangue periferico di un paziente con leucemia acuta monoblastica: sono chiaramente evidenti le segnalazioni per presenza di blasti e di granulociti immaturi (IG).